Polymerase-Kettenreaktion
Eines der wichtigsten molekulargenetischen Verfahren in der Forschung ist die Vervielfältigung von DNA-Abschnitten. Mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) ist es möglich, unbegrenzt viele Kopien eines vorliegenden DNA-Abschnittes herzustellen. Dies ist häufig nötig, da oft nur eine kleine Menge der DNA vorliegt, mit der weiter gearbeitet oder geforscht werden soll. Die Methode der PCR ähnelt in vielen Schritten der natürlichen DNA-Replikation.
Für die Polymerase-Kettenreaktion wird benötigt:
- den zu vervielfältigen DNA-Abschnitt
- Nukleotide (dNTPS)
- hitzestabile DNA-Polymerasen
- zwei DNA-Primer
Der Vorgang lässt sich in drei Schritte unterteilen:
- Denaturierung
- Hybridisierung
- Elongation
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Bei der Denaturierung wird der DNA-Strang oder DNA-Abschnitt auf ungefähr 95◦C erhitzt. Dadurch werden die Wasserstoffbrückenbindungen aufgelöst, sodass zwei DNA-Einzelstränge entstehen.
Bei der Hybridisierung wird die Temperatur des Ganzen wieder auf 50 bis 70◦C abgekühlt. Bei diesen Temperaturen lagern sich die DNA-Primer, die komplementär zu den 3’-Enden der Einzelstränge sind, an die DNA an und bilden so die Startpunkte für die DNA-Polymerase.
Bei dem dritten Schritt, der Elongation, erhitzt man das Gemisch erneut auf ungefähr 72◦C. Bei dieser Temperatur lagern sich die hitzebeständigen DNAPolymerasen an die Primer und synthetisieren ausgehend vom 3’-Ende die komplementären DNA-Stränge. Dadurch entstehen aus einem ursprünglichen, doppelsträngigen DNA-Strang zwei identische doppelsträngige DNA-Abschnitte.
Der Zyklus der PCR beginnt nach diesem letzten Schritt erneut. Bei jedem Durchgang verdoppelt sich dadurch die Anzahl der DNA-Abschnitte, es findet also eine exponentielle Vermehrung statt. Die DNA-Polymerase, die bei der PCR verwendet wird, stammt aus dem Bakterium Thermus aquaticus. Hierbei handelt es sich um ein Tiefseebakterium aus heißen Quellen, weshalb die Polymerase sehr hitzebeständig ist.
Genetischer Fingerabdruck
Die Analyse des Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) ist eine Methode zur Gendiagnose beim Menschen. Dieses Verfahren beruht darauf, dass dieselben Restriktionsenzyme die DNA einer Person immer in gleichlange Fragmente schneiden, da die Restriktionsenzyme bestimmte Erkennungssequenzen besitzen. Zwei verschiedene Menschen haben im Normalfall unterschiedliche Basenfolgen, weshalb die DNA-Fragmente bei zwei Personen nie identisch lang sind. Das DNA-Fragmentlängen-Bandmuster, was aus diesen Abschnitten entsteht, ist ein unverwechselbares und charakteristisches Merkmal einer Person. Besonders eignen sich für diese Untersuchung die sogenannten polymorphen Bereiche eines Genoms. Hierbei handelt es sich um die Abschnitte der DNA, die keine genetischen Informationen enthalten. Daher bleiben in diesen Bereichen kleiner Mutationen ohne Folge, werden nicht ausselektiert und bleiben deshalb erhalten. Diese polymorphen Bereiche unterscheiden sich sehr stark von Mensch zu Mensch und eignen sich daher besonders für die RFLP-Methode.
Vorgehen der RFLP-Methode:
- DNA wird aus Zellen der Mundschleimhaut, des Blutes oder aus anderen Zellen isoliert.
- Mithilfe der PCR (siehe Kapitel 2.8.2) werden ausgewählte polymorphe Bereiche vervielfältigt, zur Absicherung werden drei verschiedene Abschnitte untersucht.
- Die polymorphen Bereiche werden mit bestimmten Restriktionsenzymen behandelt, woraufhin unterschiedlich lange Restriktionsfragmente entstehen.
- Das Gemisch wird in eine Gel-Elektrophorese gegeben. Dieses Gerät sorgt durch elektrische Impulse dafür, dass sich die DNA-Fragmente ihrer Länge nach auftrennen und so ein charakteristisches Bandenmuster entsteht.
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